Question

【題目】CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術是近年來頗受關注的一項新技術。該基因表達系統(tǒng)主要包含引導RNA和Cas9蛋白兩個部分，引導RNA能識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結(jié)合到相應位置并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。研究人員試圖用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻產(chǎn)量基因Q基因進行編輯，請回答下列問題：

（1）研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9僅存在于原核生物，故需借助____________技術才能在水稻細胞中發(fā)揮作用。Cas9蛋白與_____________酶的功能相似。

（2）首先依據(jù)___________的部分序列設計DNA片段A（負責編碼相應引導RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體（如圖所示）。位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示_____________酶切位點。

（3）質(zhì)粒B大小為2.5kb（位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60b），經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5kb（千堿基對），連接形成的表達載體大小為___________kb。

（4）常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入水稻受體細胞，依據(jù)農(nóng)桿菌的侵染特點，目的基因?qū)⒉迦氲絋i質(zhì)粒的_______上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用，進入水稻細胞，并將其插入到____________，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。

（5）CRISRP/Cas9基因編輯技術有時存在編輯對象出錯而造成脫靶，試從引導RNA的角度分析脫靶的原因_________________________________________________。

Answer 1

【答案】轉(zhuǎn)基因（DNA重組或基因工程） 限制酶 Q基因 KpnⅠ、BamHⅠ 2.94kb T-DNA 水稻細胞染色體的DNA上 其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結(jié)合而脫靶

【解析】

根據(jù)題意分析可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術是利用該基因表達系統(tǒng)中的引導RNA能識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結(jié)合到相應位置并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結(jié)合而出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中是利用了T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到受體細胞染色體DNA分子上。

（1）若將原核生物的基因?qū)�入真核生物中并表達，需要利用基因工程技術。根據(jù)題干信息“Cas9蛋白結(jié)合到相應位置并剪切DNA”，說明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。

（2）由于是對水稻產(chǎn)量基因Q基因進行編輯，故首先需要依據(jù)Q基因的部分序列設計DNA片段A（負責編碼相應引導RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體（如圖所示）。根據(jù)片段A兩端的限制酶種類以及片段A連接在位點Ⅰ、位點Ⅱ之間，可知位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位點。

（3）質(zhì)粒B大小為2.5kb（位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60b），經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5kb（千堿基對），連接形成的表達載體大小為2.5+0.5-0.06=2.94kb。

（4）常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入水稻受體細胞，由于農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用，進入水稻細胞，并將其插入到水稻細胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。

（5）由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結(jié)合，從而導致CRISRP/Cas9基因編輯技術會出現(xiàn)編輯對象出錯而造成脫靶。