Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

（一）平板澆注法是常用的菌種分離純化方法，是將待分離的樣品用無菌水作梯度系列稀釋后，取合適稀釋度的少量菌懸液加至無菌培養皿中，立即倒入融化的固體培養基，經充分混勻后，置室溫下培養。下圖是研究人員用平板澆注法從土壤樣品中分離以工業廢甲醇為碳源的酵母菌，并進行大量培養的操作流程，請回答下列問題：

（1）為分離培養該酵母菌，配制培養基時應以___________為唯一碳源，按照培養基配方準確稱量各組分，將其溶解、定容后，調節培養基的pH，及時對培養基進行分裝，并進行_____________滅菌。

（2）取步驟②中不同梯度的稀釋液加入標記好的無菌培養皿中，在步驟③中將溫度約__________（在25℃、50℃或80℃（3個中選擇）的培養基倒入培養皿混勻，冷凝后倒置培養。經培養，可在培養基的 _____________部位出現許多單菌落。

（3）挑取平板中長出的單菌落，按步驟④所示進行劃線分離。下列敘述不合理的是_______。

A．為保證無菌操作，接種環使用前必須進行灼燒滅菌

B．劃線時應避免劃破培養基表面，以免不能形成正常菌落

C．挑取菌落時，應挑取多個菌落，分別測定酵母細胞中甲醇的含量

D．可以通過逐步提高培養基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株

（4）步驟⑤中，為使酵母數量迅速增加，培養過程中需保證充足的營養和____________供應。為監測酵母的細胞密度，將發酵液稀釋1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血細胞計數板計數5個中格中的細胞數，細胞的個數應不少于_____________，才能達到每毫升至少含2×109個細胞的預期密度。

（二）回答與基因工程及其應用有關的問題：

（1）博耶（H．Boyer）和科恩（S．Coben）將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，該研究除證明了質粒可以作為載體外，還證明了_____________________（答出兩點即可）。

（2）體外重組的質粒可通過Ca2+參與的方法導入大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與_________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞，在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是___________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細胞內表達時，產生出的蛋白質可能會被降解。為防止大腸桿菌內的蛋白質被降解，在實驗中應選用___________的大腸桿菌作為受體細胞。在提取純化蛋白質的過程中應添加________，防止目的蛋白質被降解。

Answer 1

【答案】甲醇 高壓蒸汽 50℃ 表層和內部 C 氧氣 160 體外重組的質粒可以進入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達 外殼蛋白（或答噬菌體蛋白） 細菌 蛋白酶缺陷型 蛋白酶

【解析】

1、稀釋涂布平板法在培養基上分離、培養出微生物的單個菌落，以便于計數、移植、分離，從而達到純化培養的目的。

2、選擇培養基是在培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。從土壤樣品中分離以工業廢甲醇為碳源的酵母菌，那么培養基中要加入甲醇，且是唯一碳源。

3、據圖分析，①稱量土樣，里面含有需要分離的酵母菌；②表示梯度稀釋，③④表示平板劃線法，進行純化培養；⑤表示擴大培養，獲得更多的酵母菌。

4、基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因—DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA—分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質—抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（一）（1）要想從土壤樣品中分離以工業廢甲醇為碳源的酵母菌，配制培養基時應以甲醇為唯一碳源，按照培養基配方準確稱量各組分，將其溶解、定容后，調節培養基的pH，及時對培養基進行分裝，并進行高壓蒸汽滅菌。

（2）倒平板時，培養基需要冷卻到50℃左右才能用來倒平板，所以在步驟③中應將溫度約50℃的培養基倒入培養皿混勻，冷凝后倒置培養。由于酵母菌為兼性厭氧型，所以經培養，可在培養基的表層和內部部位出現單菌落。

（3）A、接種針、接種環使用前都必須滅菌，做到無菌操作，A正確；

B、劃線時應避免劃破培養基表面，否則大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落，B正確；

C、挑取菌落時，應挑取多個菌落，分別測定培養液中甲醇的含量，C錯誤；

D、可以通過逐步提高培養基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株，D正確。

故選C。

（4）有氧呼吸能為酵母菌的繁殖提供大量能量，所以步驟⑤中，為使酵母數量迅速增加，培養過程中需保證充足的營養和氧氣供應，以促進有氧呼吸，進而大量繁殖。假設理論上5個中方格的活細胞數不應少于n才能達到每毫升2×109個活細胞的預期密度，根據“將發酵液稀釋1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血細胞計數板計數”，可列式為25÷5×n÷0.4×1000×1000=2×109，解得n=160，所以5個中方格中酵母菌數不少于160。

（二）（1）將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，說明體外重組的質粒可以進入受體細胞；也可說明真核生物基因可在原核細胞中表達。

（2）噬菌體為DNA病毒，由DNA和蛋白質組成，所以體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質外殼組裝才能形成完整噬菌體。噬菌體屬于細菌病毒，宿主細胞只能是細菌，所以在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是細菌。

（3）真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解，為防止蛋白質被降解，選擇的大腸桿菌體內應該沒有可以降解蛋白質的酶，所以選擇蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加蛋白酶的抑制劑。