Question

【題目】某質粒上有SaiⅠ、HindⅢ、 BamHⅠ三種限制酶切割位點，同時還含有抗四壞素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質粒獲得轉基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。回答下列問題：

（1）將目的基因導入植物細胞，釆用最多的方法是農桿菌轉化法。其中用到的質粒是__________；該質粒含有一段特殊的DNA片段，稱為__________。該方法從農桿菌的作用是__________。

（2）在構建重組質粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質粒相比，選用HindⅢ和SaiⅠ兩種酶的好處是____________________。

（3）含有目的基因的農桿菌可根據標記基因進行篩選。若農桿菌在含有氨芐青霉素和四環素的培養基上都可以生長繁殖，農桿菌中是否巳含有目的基因? __________（填“是”或“否”）。為什么？__________。

（4）將已經轉化的農桿菌進行如下篩選，篩選出符合要求的農桿菌。先把轉化的農桿菌接種到A培養基中培養，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個菌落，分別接種到B（含氨芐青霉素）和C（含四環素和氨芐青霉素）兩個培養基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如下圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中?請在圖中相應的位置上圈出來。

Answer 1

【答案】 Ti質粒 T-DNA 感染煙草細胞，把目的基因插入到煙草細胞的染色體DNA上 防止目的基因自連和質粒自連,以形成帶有目的基因的重組質粒 否 含有目的基因的質粒中抗四環素的基因被破壞

【解析】試題分析：農桿菌轉化法主要操作步驟是將含目的基因的重組質粒首先導入土壤農桿菌中，再通過土壤農桿菌侵染植物細胞，使植物細胞獲得重組質粒，利用質粒中含有的T-DNA片段將目的基因插入到植物細胞的染色體DNA上整合，最后進行選擇培養、篩選獲得轉基因植株。

（1）結合前面的分析，根據農桿菌轉化法的原理，該方法中應用的質粒必須是具有可轉移的T-DNA的Ti質粒。該方法中農桿菌的作用是感染煙草細胞，進而把目的基因插入到煙草細胞的染色體DNA上。

（2）在構建重組質粒時，如果只用一種酶切割目的基因的兩端及質粒，切割后的目的基因或者質粒各自出現的兩個黏性末端堿基序列正好能互補配對，容易發生目的基因或質粒各自自連的現象，但是如果選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶切割目的基因或質粒，則可以避免這種自連現象的發生，這樣將切割后的它們混合，在DNA連接酶的作用下，才可以得到更多的目的基因和質粒相連接的重組質粒。

（3）根據圖示分析，所給的限制酶在質粒上的切割位點都位于抗四環素基因的部位，如果目的基因插入到質粒中，得到重組質粒，則含重組質粒的農桿菌只含有完整的抗氨芐青霉素基因，不含完整的抗四環素基因（被目的基因破壞），而這種農桿菌不能在同時含兩種抗生素的培養基中正常生長繁殖，只能在含抗氨芐青霉素的培養基中生長繁殖。

（4）結合圖示操作分析，由于B、C兩個培養基中相同位置接種的來自A中的菌種是都能抗氨芐青霉素的，在B、C中培養對比分析，由C中培養的有兩個位置的菌落消失，說明這兩個位置的菌種只能抗氨芐青霉素，不能同時抗兩種抗生素，所以推測這兩個位置的菌種是含有重組質粒的農桿菌（見參考答案的兩圓圈處）。