Question

【題目】許多大腸桿菌的質(zhì)粒上含有lacZ基因，其編碼的產(chǎn)物β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色�；�因工程中常利用該原理從導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞中篩選出真正導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞，過程如下圖。請據(jù)圖回答：

（1）基因工程中，構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是 。

（2）限制酶EcoRⅠ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓AATTC—，SmaⅠ的識別序列和切點(diǎn)是—CCC↓GGG—。圖中目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接相應(yīng)的末端，連接的末端序列是 ，連接過程中需要的基本工具是 。

（3）轉(zhuǎn)化過程中，大腸桿菌應(yīng)先用 處理，使其處于能吸收周圍DNA的狀態(tài)。

（4）菌落的顏色為白色的是 ，原因是 。

（5）菌落③中的目的基因是否能表達(dá)，可采用的檢測辦法是 。

Answer 1

【答案】（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，能遺傳給后代，并表達(dá)和發(fā)揮作用

（2）-----TTAA DNA連接酶

（3）Ca2＋

（4）菌落③ lacZ標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因，不能表達(dá)出β-半乳糖苷酶，故菌落為白色

（5）抗原—抗體雜交

【解析】

試題分析：（1）基因工程的核心步驟是構(gòu)建基因表達(dá)載體，目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，能遺傳給后代，并表達(dá)和發(fā)揮作用。

（2）由圖可知，目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識別序列，右側(cè)是限制酶SmaI的識別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識別序列，所以需要用限制酶EcoRI來切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和SmaI來切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA，連接過程中需要DNA連接酶的催化。

（3）將目的基因?qū)�入大腸桿菌細(xì)胞之前，應(yīng)先用Ca2+處理大腸桿菌，使其處于能吸收周圍DNA的感受態(tài)。

（4）用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時，會破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，菌落顏色為白色。

（5）檢測目的基因是否表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可采用抗原一抗體雜交法。