Question

【題目】中科院動物研究所利用CRISPR/Cas9技術，向豬的基因組內插入一個解耦聯蛋白基因（UCP1)，經過基因改造的豬瘦肉率高、脂肪少、抗寒能力強。下圖是基因改造過程中涉及的相關限制酶及酶切位點。請回答下列問題：

（1）圖中的抗生素抗性基因的作用是作為___________基因，以便于篩選。為了獲取重組質粒，除了使用限制酶外，還需使用____酶。

（2）重組質粒上應有_____識別和結合的部位，以驅動解耦聯蛋白基因（UCP1)轉錄，該部位稱為_____。

（3）在構建基因表達載體過程中，為避免出現質粒和目的基因自身環化，常用_________兩種限制酶同時切割質粒和UCP1基因。

（4）獲得目的基因后，常采用PCR技術擴增目的基因，在此過程中，由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA單鏈，只能從_____________端延伸DNA單鏈，因此需要加入引物。

（5）科研人員通過____法，將基因表達載體導入豬的受精卵中�？赏ㄟ^____技術，來檢測UCP1基因是否己導入到豬受精卵細胞。

Answer 1

【答案】標記 DNA連接 RNA聚合酶 啟動子 BamHI 和 HindIII 3′ 顯微注射 DNA分子雜交

【解析】

①分析題圖：質粒上和含解耦聯蛋白基因（UCP1)的外源DNA中含有的酶切位點相同，其中SmaⅠ的識別位點位于UCP1基因和抗生素抗性基因內部，UCP1基因的兩端均有EcoRⅠ的識別位點，而且BamHI、 HindIII的識別位點分別位于UCP1基因的兩端。②質粒含有的抗生素抗性基因屬于標記基因，標記基因的作用是：鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。③基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等，其中的啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA。④PCR技術的原理的DNA雙鏈復制的原理，在DNA復制時，DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA單鏈。⑤將目的基因導入動物細胞常采用顯微注射法，受體細胞是受精卵；檢測目的基因是否插入到受體細胞的基因組中用DNA分子雜交技術。

(1)圖中的抗生素抗性基因作為標記基因，以便篩選含有目的基因的受體細胞。為了獲取重組質粒，除了使用限制酶外，還需使用DNA連接酶將目的基因與質粒連接。

(2) 重組質粒的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等，其中的啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動解耦聯蛋白基因（UCP1)轉錄出mRNA。

(3) 圖中質粒上和含UCP1基因的外源DNA中含有的酶切位點相同，而且在UCP1基因的兩端分別存在BamHI和 HindIII的識別位點，因此在構建基因表達載體過程中，使用BamHI 和 HindIII這兩種限制酶同時切割質粒和含UCP1基因的外源DNA，可以避免出現質粒和目的基因（UCP1基因）自身環化。

(4)利用PCR技術擴增目的基因的過程中，由于DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA單鏈，因此需要加入引物。

(5) 將基因表達載體導入豬的受精卵中，應采用顯微注射法。UCP1基因屬于目的基因，檢測目的基因是否己導入到豬受精卵細胞中，應采用DNA分子雜交技術。