Question

【題目】斑馬魚的HuC基因在早期胚胎神經細胞中選擇性表達，研究人員構建了HuC基因的表達載體，并導入到斑馬魚細胞中研究其作用，請回答：

（1）為獲取HuC基因，研究人員從早期胚胎神經細胞中提取HuC基因的mRNA，通過_________獲得大量的DNA，進而構建出HuC基因的______________。

（2）DraⅢ， SnaBⅠ等是質粒上不同限制酶的切割位點。為獲得HuC基因——綠色熒光蛋白基因的表達載體，需要對HuC基因和質粒選用圖中的____________酶進行切割，這樣做的原因是_________。不選擇NotⅠ酶切割的原因是_____________。

（3）用Ca2+處理大腸桿菌，大腸桿菌細胞即能夠______________。實驗過程中可以采用在熒光顯微鏡下觀察________________________或者在培養基中添加______________，篩選出導入表達載體的大腸桿菌。

Answer 1

【答案】逆轉錄和PCR技術擴增 cDNA文庫 EcoRⅠ酶和BamHⅠ 可以防止目的基因和質粒自身環化以及目的基因與質粒反向連接 破壞標記基因無法篩選（且沒有啟動子） 吸收周圍環境中的DNA分子 表達的綠色熒光蛋白菌落 卡那霉素

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因—DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA—分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質—抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）從早期胚胎神經細胞中提取HuC基因的mRNA，通過逆轉錄過程合成目的基因，并通過PCR技術在體外擴增可獲得大量的目的基因，進而構建出HuC基因的cDNA文庫。

（2）構建基因表達載體時，不能破壞運載體上的啟動子、復制原點，以及運載體上需要保留標記基因，為了防止目的基因和質粒自身環化以及目的基因與質粒反向連接，常用不同的限制酶切割質粒和目的基因，結合圖示中各種限制酶的酶切位點可知，為獲得HuC基因——綠色熒光蛋白基因的表達載體，需要對HuC基因和質粒選用圖中的EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶進行切割。卡那霉素抗性基因為標記基因，若用NotⅠ酶切割，將會導致卡那霉素抗性基因被破壞，且切割后的質粒會失去啟動子，使基因表達載體中缺少標記基因無法選擇，且沒有啟動子無法轉錄，所以不選擇NotⅠ酶切割質粒。

（3）用Ca2+處理大腸桿菌使之成為感受態細胞，易于吸收周圍環境中的DNA分子。由于綠色熒光蛋白表達后會發綠光，所以實驗過程中可以采用在熒光顯微鏡下觀察表達的綠色熒光蛋白菌落或者在培養基中添加卡那霉素，篩選出導入表達載體的大腸桿菌。