Question

【題目】回答下列（一）（二）小題。

（一）枯草桿菌廣泛分布于土壤及腐敗的有機物中，某工廠為生產耐高溫的淀粉酶，開展了枯草桿菌菌株的篩選、酶的固定化分析研究，其流程如圖所示：

（1）配制培養基：該培養基應以___________為唯一碳源。

（2）取土樣加入盛有無菌水的三角瓶中，常壓加熱至水沸騰后維持20分鐘，其目的是___________，取出三角瓶置于37℃培養24小時，液面產生黃白色皮膜，用接種環挑取菌膜，用___________法接種到平板上，于37℃恒溫箱中培養24小時，取出觀察，若淀粉被水解，菌落周圍會產生___________，選擇優良的菌株進行擴大培養。

（3）在建立和優化淀粉酶固定化酶柱連續生產工藝研究中，通常要分析汁液中各種成分的濃度和所用酶的活性，然后主要優化各固定化酶反應器中的___________（答出2點即可）、反應pH和酶反應時間等因素。其中，酶反應時間可通過___________來調節。

（4）固定化酶柱在使用后，需用___________洗滌，放置于4℃冰箱中。

（二）高溫脅迫是影響植物生長發育的重要因素之一，高溫逆境會使番茄的生長發育受到限制，轉入codA基因的番茄對高溫的耐 受性大于野生型番茄。

（1）如圖為質粒限制性核酸內切酶酶切圖譜。codA基因不含圖中限制性核酸內切酶識別序列。為使PCR技術擴增的codA基因能重組進該質粒，擴增的codA基因兩端需分別引入___________和___________不同限制性核酸內切酶的識別序列。

（2）制備番茄的原生質體時，在___________環境下用酶解法處理番茄的根尖、葉片等細胞。

（3）導入目的基因的番茄細胞經___________形成愈傷組織，通過調節___________，可以從這種愈傷組織誘導出芽和根的頂端分生組織，由此再生出新的植株。

（4）番茄的培養細胞在長期培養中，其胚胎發生和器官形成能力下降，可能原因有___________（寫出2點即可）。

（5）種植業和畜牧業是人類食物生產系統的兩大支柱，兩者結合的優化設計需要按照___________規律進行綜合優化，使系統從總體上獲得最佳的經濟效益、生態效益和社會效益。

Answer 1

【答案】淀粉 篩選出耐高溫菌株 劃線分離 透明圈 固定化酶的量、反應液溫度 控制反應器液體流速 10倍柱體積的蒸餾水 NdeⅠ BamHⅠ 0.5-0.6mol/LD甘露醇溶液 脫分化 營養物質和生長調節劑的適當配比 染色體畸變、細胞核變異、非整倍體產生；細胞或組織中激素平衡被打破、細胞對外源生長物質的敏感性改變；缺乏成胚性的細胞系 生態與經濟

【解析】

1、微生物的篩選與分離需要使用選擇培養基。常用的接種方法主要有平板劃線法和稀釋涂布平板法。固定化酶和固定化細胞的方法主要有包埋法、物理吸附法和化學結合法。影響酶的活性的因素主要有溫度和pH等。

2、基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（一）（1）能分解淀粉的微生物能夠產生淀粉酶，為生產耐高溫的淀粉酶，需要培養并篩選能夠分解淀粉的微生物，所以培養基應以淀粉為唯一碳源。

（2）耐高溫的菌體在高溫條件下可生存，而不耐高溫的微生物在高溫條件下不能生存，故取土樣加入盛有無菌水的三角瓶中，常壓加熱至水沸騰后維持20分鐘，其目的是篩選出耐高溫菌株，取出三角瓶置于37℃培養24小時，液面產生黃白色皮膜，用接種環挑取菌膜，用平板劃線法接種到平板上，于37℃恒溫箱中培養24小時，取出觀察，若淀粉被水解，菌落周圍會產生透明圈，選擇優良的菌株進行擴大培養。
（3）在建立和優化淀粉酶固定化酶柱連續生產工藝研究中，通常要分析汁液中各種成分的濃度和所用酶的活性，然后主要優化各固定化酶反應器中的固定化酶的量、反應液溫度、反應pH和酶反應時間等因素。其中，酶反應時間可通過控制反應器液體流速來調節。
（4）固定化酶柱在使用后，需用10倍柱體積的蒸餾水洗滌，放置于4℃冰箱中。

（二）（1）根據啟動子和終止子的生理作用可知，目的基因應導入啟動子和終止子之間。圖中看出，兩者之間存在于三種限制酶切點，但是由于XbaⅠ在質粒上不止一個酶切位點，因此為使PCR擴增的codA基因重組進該質粒，擴增的codA基因兩端需分別引入NdeⅠ和BamHⅠ限制酶的識別序列。
（2）根據滲透原理，制備番茄的原生質體時，在0.5-0.6mol/LD甘露醇溶液環境下用酶解法處理番茄的根尖、葉片等細胞。
（3）導入目的基因的番茄細胞經脫分化形成愈傷組織，通過調過營養物質和生長調節劑的適當配比可以從這種愈傷組織誘導出芽和根的頂端分生組織，由此再生出新的植株。

（4）番茄的培養細胞在長期培養中，其胚胎發生和器官形成能力下降，可能原因有染色體畸變、細胞核變異、非整倍體產生；細胞或組織中激素平衡被打破、細胞對外源生長物質的敏感性改變；缺乏成胚性的細胞系等。
（5）種植業和畜牧業是人類食物生產系統的兩大支柱，兩者結合的優化設計需要按照生態與經濟規律進行綜合優化，使系統從總體上獲得最佳的經濟效益、生態效益和社會效益。