Question

【題目】血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，負責血液中O2或CO2的運輸。據血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。

（1）將實驗流程補充完整：A為_____，凝膠色譜法是根據_____來分離蛋白質的有效方法。

（2）洗滌紅細胞的目的是去除_____。洗滌干凈的標志是_____。釋放血紅蛋白的過程中起作用的物質有_____。

（3）在洗脫過程中加入物質的量濃度為20mol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）的目的是_____。

（4）在裝填色譜柱時不得有氣泡存在，因為_____。在凝膠色譜操作過程中，不能發生洗脫液流干、露出凝膠顆粒的情況，一旦發生這種情況，需重新裝填凝膠色譜柱。如果紅色區帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。

Answer 1

【答案】血紅蛋白的釋放 相對分子質量的大小 雜蛋白（血漿蛋白） 離心后的上清液中沒有黃色 蒸餾水和甲苯 準確模擬生物體內的生理環境，保持體外的pH和體內一致 氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果

【解析】

1、血紅蛋的提取與分離的實驗步驟主要有(1)樣品處理：紅細胞的洗滌→血紅蛋白的釋放→分離血紅蛋白溶液→透析；（2）粗分離；（3）純化：凝膠色譜柱的制作→凝膠色譜柱的裝填→樣品的加入和洗脫；（4）純度鑒定——聚丙烯酰胺膠電泳。

2、凝膠色譜法的原理是：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。所以凝膠色譜法是根據相對分子質量大小而達到蛋白質分離的有效方法。

3、洗滌紅細胞的目的是去除雜質蛋白，釋放血紅蛋白的過程是讓紅細胞吸水漲破。如果分層不明顯，可能是洗滌次數少，無法除去血漿蛋白。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續血紅蛋白的提取純度。重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈，因為甲苯是表面活性劑的一種，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是蒸餾水和甲苯。

4、磷酸緩沖液（PH為7.0)能夠準確模擬生物體內的生理環境，保持體外的pH和體內的一致。如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區帶均勻一致地移動，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區帶歪曲、散亂、變寬,說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。

據分析可知：

（1）將實驗流程補充完整：A為血紅蛋白的釋放，凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小來分離蛋白質的有效方法。

（2）洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白（血漿蛋白）。洗滌干凈的標志是離心后的上清液中沒有黃色。釋放血紅蛋白的過程中起作用的物質有蒸餾水和甲苯。

（3）在洗脫過程中加入物質的量濃度為20mol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）的目的是準確模擬生物體內的生理環境，保持體外的pH和體內一致。

（4）在裝填色譜柱時不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。