Question

【題目】I．新一代基因編輯工具由 Cas9（一種限制性核酸內切酶）和向導RNA構成。該復合體能與DNA分子上的特定序列結合，并在合適位點切斷DNA雙鏈（如下圖所示）。DNA被切斷后，細胞會啟動DNA損傷修復機制，在此基礎上如果為細胞提供一個修復模板，細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變，從而實現基因編輯。請回答：

（1）在將編碼Cas9的基因導入真核細胞的轉基因操作中，若控制合成Cas9的基因序列已知，可用_______方法合成目的基因，再構建表達載體導入真核細胞。上述轉基因操作成功的標志________________。

（2）如圖1所示，基因編輯工具發揮作用時，向導RNA分子的序列與基因組DNA中特定堿基序列因為堿基互補序列所以能結合在一起，然后由Cas9催化__________鍵斷裂，從而使 DNA分子斷裂。

（3）一般來說，在使用基因編輯工具對不同基因進行編輯時，應使用Cas9和_____（填“相同”或“不同”）的向導RNA進行基因的相關編輯。

（4）如圖2所示，若用兩種識別切割序列完全不同的限制酶E和F從基因組DNA上切下目的基因，并將之取代質粒pZHZ1(3.7kb，1kb=1000對堿基)上相應的E—F區域(0.2kb)。已知在質粒pZHZl中，限制酶G切割位點距限制酶E切割位點0．8kb，限制酶H切割位點距限制酶F切割位點O．5kb。若分別用限制酶G和H酶切兩份重組質粒pZHZ2樣品，據表所列為酶切結果。請將目的基因內部的限制酶G和H切割位點標注在圖3中。_______

Ⅱ．青光眼是導致人類失明的三大致盲眼病之一，其中發育性青光眼（嬰幼兒型和青少年型）具有明顯的家族遺傳傾向。檢查發現，發育型青光眼患者角膜小梁細胞中M蛋白異常。為研究其病因，研究者用含綠色熒光蛋白基因G或紅色熒光蛋白基因R的質粒、正常人M蛋白基因（M+）或青光眼患者M蛋白基因（M-），構建基因表達載體，分別導入Hela細胞中進行培養，一段時間后檢測培養液和細胞中熒光的分布情況，實驗分組及檢測結果如下表（示只含熒光蛋白基因的質粒片段；示含熒光蛋白基因和M蛋白基因的質粒片段，此時兩基因表達的產物是一個整體）。

（1） 據下表推測，發育型青光眼的病因是_______異常導致其指導合成的M蛋白異常，導致小梁細胞中的M蛋白___________________，而在細胞中大量積累，最終導致小梁細胞功能異常。

（2）下表中第___________組實驗可以判斷：發育型青光眼是顯性遺傳病。

Answer 1

【答案】化學 控制Cas9基因的成功表達 磷酸二酯 不同 M蛋白基因 不能正常地分泌到細胞外 4組、5組、6組

【解析】

（1）獲得目的基因的方法：①從基因文庫中獲取；②利用PCR技術擴增；③人工合成(化學合成)。原核生物的基因采取直接分離獲得，真核生物的基因一般是人工合成。

（2）DNA重組技術至少需要三種工具：限制性核酸內切酶(限制酶)、DNA連接酶、運載體。

（3）目的基因的檢測與鑒定，常用基因探針--用放射性同位素(或熒光分子)標記的含有目的基因DNA片段。

Ⅰ、分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因常用DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA常用分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質常用抗原-抗體雜交技術。

Ⅱ、個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

I．（1）對于基因序列已知的目的基因可以通過DNA合成儀用化學法直接人工合成。轉基因成功的標志是合成目的基因的產物，本題中應為控制Cas9基因的成功表達。

（2）Cas9是一種限制性核酸內切酶，催化脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵水解，從而使 DNA分子斷裂。

（3）如圖所示，基因編輯工具發揮作用時，向導RNA分子的序列與基因組DNA中特定堿基序列因為堿基序列互補所以能結合在一起，所以在使用基因編輯工具對不同基因進行編輯時，應使用Cas9和不同的向導RNA進行基因的相關編輯。

（4）如圖2所示，若用兩種識別切割序列完全不同的限制酶E和F從基因組DNA上切下目的基因，并將之取代質粒pZHZ1(3.7kb，1kb=1000對堿基)上相應的E—F區域(0.2kb)。根據限制酶G和H單獨切割重組質粒得到的兩個片段之和均為4.7kb，說明目的基因的長度為4.7+0.2-3.7=1.2kb，已知在質粒pZHZl中，限制酶G切割位點距限制酶E切割位點0．8kb，限制酶H切割位點距限制酶F切割位點O．5kb，若分別用限制酶G和H酶切兩份重組質粒pZHZ2樣品，據表所列酶切結果可知，在重組質粒上含有兩個限制酶G切割位點和兩個限制酶H切割位點，說明插入的目的基因上分別含有一個限制酶G切割位點和一個限制酶H切割位點，根據單獨使用限制酶G切割形成1.6kb和3.1kb兩段，由于GE為0.8kb，說明距離E位點0.8kb的目的基因上有一個限制酶G切割位點，同理，根據單獨使用限制酶H切割重組質粒形成1.2kb和3.5kb兩段，由于FH為0.5kb，說明距離限制酶F切割位點的0.7kb的目的基因上有一個限制酶H切割位點（即距離質粒上H點1.2kb的目的基因上有限制酶H的切割位點），綜上分析，目的基因上限制酶G切割位點和限制酶H切割位點之間的距離為0.3kb，故圖示如下：。

Ⅱ．（1）根據1和2組實驗結果可知，在沒有M蛋白的情況下，熒光標記只存在于細胞內，而和正常M蛋白基因連接后，熒光標記出現在了培養液中，即正常M蛋白合成后會分泌到細胞外，但是和青光眼患者M蛋白基因連接后，細胞外將不會出現熒光標記，由此可見，發育型青光眼的病因是M蛋白基因異常導致其指導合成的M蛋白異常，導致小梁細胞中的M蛋白不能正常地分泌到細胞外而在細胞中大量積累，最終導致小梁細胞功能異常。

（2）顯性遺傳病的個體只要含有致病基因就患病，結合上一小題的分析可知，表中第4組、5組、6組組實驗可以為“發育型青光眼是顯性遺傳病”這一結論提供重要證據。