Question

【題目】為研究野生型擬南芥抗鹽機理，研究人員利用T-DNA插入擬南芥基因組中，得突變體Y。

（1）種植野生型擬南芥，將地上部分浸入______菌懸浮液中以實現轉化，該菌的T-DNA上需帶有抗除草劑基因以便篩選。在適宜條件下培養，收獲種子（稱為T1代）。

（2）假設所處理植株為T-DNA單拷貝插入，則T1代植株自交后所結種子中具有抗除草劑性狀的占______。繼續種植具有抗除草劑性狀的種子，長成植株后進行自交，若______，表明獲得了純合的轉基因突變體植株Y。

（3）野生型擬南芥的抗鹽性狀與D基因密切相關，T-DNA插入到D基因中，致使該基因失活，失活后的基因記為d。收集上述突變體Y葉片并提取DNA，分別用引物“LB+RP”組合及“LP+RP”組合進行PCR擴增。已知插入完整T-DNA后，“LP+RP”不能完成PCR擴增如圖．檢測擴增結果中，若______，則相應植株的基因型為Dd；若______，則相應植株的基因型為dd。

（4）研究人員收集7個突變體的葉片，提取葉片總mRNA，并逆轉錄為cDNA，利用特異性引物進行PCR擴增，結果如圖．基因actin在擬南芥中表達相對穩定，作為本實驗的______，結果表明______號植株因T-DNA的插入，D基因完全沉默。

（5）將野生型和突變體種子消毒后，分別播種于含有不同濃度NaCl培養基中，觀察種子萌發情況，結果見如圖．

由如圖可知，在不含NaCl的培養基上，野生型和突變體種子的萌發率______；隨著NaCl濃度的升高，突變體種子的萌發率明顯______。

（6）野生型在高濃度NaCl脅迫下，脫落酸（ABA）含量增加，并迅速參與到抗脅迫的反應中。突變體D基因由于T-DNA的插入不能正常表達，導致突變體的抗鹽性下降，由此推測D基因抗鹽作用的機理是______。

Answer 1

【答案】農桿 3/4 全部具有抗除草劑性狀 “LB+RP”組合和“LP+RP”組合均能進行PCR擴增 “LB+RP”組合能擴增，“LP+RP”組合不能擴增 參照或標準 5 沒有明顯差異 下降 D基因的表達會促進ABA的合成，從而提高抗鹽能力

【解析】

基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）研究人員利用T-DNA插入擬南芥基因組中，T-DNA是農桿菌質粒的組成，所以種植野生型擬南芥，將地上部分浸入農桿菌懸浮液中以實現轉化，該菌的T-DNA上需帶有抗除草劑基因以便篩選。在適宜條件下培養，收獲種子。

（2）假設所處理植株為T-DNA單拷貝插入，則T1代植株基因型為雜合子，自交后所結種子中具有抗除草劑性狀的占3/4，繼續種植具有抗除草劑性狀的種子，長成植株后進行自交，若全部具有抗除草劑性狀或沒有性狀分離，表明獲得了純合的轉基因突變體植株Y。

（3）已知T-DNA插入到D基因中，致使該基因失活，失活后的基因記為d，由圖示引物的位置可知，若檢測擴增結果中，若“LB+RP”組合和“LP+RP”組合均能進行PCR擴增，則相應植株的基因型為Dd；若“LB+RP”組合能擴增，“LP+RP”組合不能擴增，則相應植株的基因型為dd。

（4）基因actin在擬南芥中表達相對穩定，作為本實驗的參照或標準，結果表明5號植株因T-DNA的插入，使其沒有表達出D基因的產物，即D基因完全沉默。

（5）由圖3可知，在不含NaCl的培養基上，野生型和突變體種子的萌發率沒有明顯差異；隨著NaCl濃度的升高，突變體種子的萌發率明顯下降。

（6）野生型在高濃度NaCl脅迫下，脫落酸（ABA）含量增加，并迅速參與到抗脅迫的反應中。突變體D基因由于T-DNA的插入不能正常表達，導致突變體的抗鹽性下降，由此推測D基因抗鹽作用的機理是D基因的表達會促進ABA的合成，從而提高抗鹽能力。