Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細胞因子，廣泛用于動物領域的抗病毒治療。科研人員將雞干擾素基因作為目的基因，構建基因表達載體，通過農桿菌介導法導入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：

（1）步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據是____。科研人員還在兩種引物的一端分別加上了__________和___________序列，以便于后續的剪切和連接。為防止酶切產物自身環化，構建表達載體需用兩種限制酶，選擇的原則是_________。

A．Ti質粒內，每種限制酶只有一個切割位點

B．目的基因編碼蛋白質的序列中，每種限制酶只有一個切割位點

C．酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti質粒形成的兩個黏性末端序列相同

（2）步驟②所構建的基因表達載體中未標注出的必需元件還有___________，步驟③中需先用______處理農桿菌以便將基因表達載體導入細胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細胞的RNA后，先通過________獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是___________。

（4）用煙草花葉病毒對獲得的轉基因煙草和普通煙草進行接種實驗，接種后第19天對照組植株進入病情指數（植物受病毒侵染的嚴重程度）為100的平臺期，而轉基因植株在第______天才進入平臺期，但此時的病情指數為79。說明轉基因煙草植株對病毒的侵染表現出一定的抗性，但抗性較低，可能的原因有__________。

Answer 1

【答案】 雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC AC 復制原點 Ca2+ 逆轉錄 雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉錄 22 實驗得到的干擾素表達量較低，未能很好啟動機體產生抗性；或：病毒接種量過大，相對來說干擾素誘導調控作用滯后；或：植物體內缺乏干擾素受體，導致外源基因表達的干擾素誘導或調控作用減弱

【解析】試題分析：分析圖解，圖中過程①表示獲取目的基因，過程②表示基因表達載體的構建，過程③表示將重組質粒導入農桿菌，過程④表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質粒，因此科研人員還在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后續的剪切和連接。為防止酶切產物自身環化，構建表達載體需用兩種限制酶，Ti質粒內，每種限制酶只有一個切割位點，A正確；目的基因編碼蛋白質的序列中，不能有限制酶的切割位點，B錯誤；酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同，否則會自我環化，C正確；酶切后，Ti質粒形成的兩個黏性末端序列應該不同，否則會自我連接，D錯誤。

（2）基因表達載體必需具備的成分有目的基因、標記基因、啟動子、終止子和復制原點，圖中還缺復制原點；微生物細胞作為受體細胞時，需要鈣離子處理使其變為感受態細胞，因此過程③中需先用Ca2+（或CaCl2）處理農桿菌以便將基因表達載體導入細胞。

（3）提取的愈傷組織細胞的RNA通過逆轉錄過程得到DNA；最終未能檢測出干擾素基因，可能是因為雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉錄。

（4）據圖分析，接種后第19天對照組植株進入病情指數為100的平臺期，而轉基因植株在第22天才進入平臺期，且此時的病情指數為79，說明轉基因煙草植株對病毒的侵染表現出一定的抗性，但抗性較低，可能是因為實驗得到的干擾素表達量較低，未能很好啟動機體產生抗性（或病毒接種量過大，相對來說干擾素誘導調控作用滯后；或植物體內缺乏干擾素受體，導致外源基因表達的干擾素誘導或調控作用減弱）。