Question

【題目】圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度（bp即堿基對）和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列。現(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請回答下列問題：

（1）若用限制酶SmaⅠ完全切割圖1中DNA片段，其產(chǎn)物長度為____________________。

（2）若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對被T-A堿基對替換，那么基因D就突變?yōu)榛�因d。從隱性純合子分離出圖1及其對應的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，產(chǎn)物中共有__________種不同DNA片段。為了提高實驗成功率，需要通過__________技術(shù)擴增目的基因，以獲得大量的目的基因。

（3）若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行，形成重組質(zhì)粒，那么應選用的限制酶是__________。在導入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含質(zhì)粒的大腸桿菌，一般先用添加__________的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后將生長的菌接種到只含__________的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可進一步篩選出含重組質(zhì)粒的受體細胞。

（4）假設用BamHⅠ切割DNA獲取目的基因，用MboⅠ切割質(zhì)粒，然后形成重組質(zhì)粒，若將插入在抗生素B抗性基因處的目的基因重新切割下來，能否用BamHⅠ?__________。為什么？____________________。

Answer 1

【答案】 537bp、790bp、661bp 2 PCR BamHⅠ 抗生素B 抗生素A 不一定 因為目的基因和抗生素B抗性基因拼接處不一定出現(xiàn)GGATCC

【解析】試題分析：根據(jù)題意，限制酶SmaⅠ的酶切位點是CCC↓GGG，完全切割圖中1的DNA片段，產(chǎn)生平末端，在圖1中有兩個限制酶SmaⅠ的酶切位點，DNA將切割成3個片段，結(jié)合圖解，三個片段的長度為534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp；構(gòu)建重組質(zhì)粒時，目的基因D不能限制酶MspⅠ和SmaⅠ，這兩種限制酶的酶切位點在目的基因的中間，如果用其切割，目的基因D就會被破壞；也不能用限制酶MboⅠ，它的目的基因上有兩個酶切位點，如果用其切割，質(zhì)粒上的標記基因會被破壞，就沒有辦法進行重組質(zhì)粒的檢測，故應選用限制酶BamHⅠ。

（1）根據(jù)前面的分析可知，用限制酶SmaⅠ完全切割該DNA片段，其產(chǎn)物長度為537bp、790bp、661bp。

（2）若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對被T-A堿基對替換，基因D就突變?yōu)榛�因d，那么基因d上只有一個限制酶SmaⅠ切割位點，被限制酶SmaⅠ切割的產(chǎn)物長度為534+796-3=1327kb、658+3=661bp，因此從隱性純合子（dd）分離出圖1及其對應的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，產(chǎn)物中共有2種不同DNA片段。為了提高試驗成功率，需要通過PCR技術(shù)擴增目的基因，以獲得大量的目的基因。

（3）結(jié)合題意，由圖1可知，為了切割出完整的目的基因，由于在目的基因兩側(cè)都有GGATCC序列，而該序列可能被限制酶BamHⅠ和MboⅠ的識別并切割；再分析質(zhì)粒上的GGATCC序列可知，若選用限制酶MboⅠ會將質(zhì)粒中兩個抗性基因（標記基因A、B）都破壞掉，所以為了便于成功篩選導入目的基因的受體細胞，只能選用只破壞一種抗性基因的限制酶，即BamHⅠ。用限制酶BamHⅠ切割質(zhì)粒后，用限制酶BamHⅠ切割破壞了抗生素A抗性基因，但沒有破環(huán)抗生素B抗性基因，因此首先用含有抗生素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，能生存下來的是含有普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的大腸桿菌；再用影印法將培養(yǎng)的大腸桿菌接種在含有抗生素A的培養(yǎng)基培養(yǎng)，能生存下來的是含有普通質(zhì)粒的大腸桿菌，通過對比分析即可得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。

（4）若將插入在抗生素B抗性基因處的目的基因重新切割下來，不一定能用BamHⅠ，因為目的基因和抗生素B抗性基因拼接處不一定出現(xiàn)GGATCC。