Question

【題目】下圖1為某種常用質粒的序列圖，LacZ基因編碼的酶能使無色的X—gal變為藍色，Ampr為氨芐青霉素抗性基因。圖2為目的基因的序列及其相關限制酶的識別序列。請回答下列問題：

⑴若要篩選成功導入目的基因的重組質粒，培養基中應加入的物質有__________和___________。基因表達載體的組成除了目的基因外，還必須有_______、終止子和標記基因等。對獲取的目的基因可用_________技術對其擴增。

⑵實驗小組用BamHⅠ和BlgⅡ兩種限制酶切割目的基因和質粒，構建重組質粒后導入大腸桿菌中，在篩選重組質粒的培養基上，若大腸桿菌菌落顯藍色，說明導入了__________；若大腸桿菌菌落顯白色，說明導入了_________。沒有導入任何外源DNA的大腸桿菌_______(填“能”或“不能）在該培養基上生存。

⑶將若干個質粒和目的基因用BamHⅠ和BlgⅡ兩種限制酶切割后，用DNA連接酶相連，若僅考慮質粒與目的基因相連接，會有________種連接方式。然后再用BamHⅠ和EcoRⅠ切割成功連接后的產物，獲得了長度為0.8kb、3.8kb、1.1kb和3.5kb四種長度的DNA片段，則目的基因的長度為______kb(已知目的基因的長度大于2kb，1kb=1000個堿基對）。

Answer 1

【答案】 X—gal 氨芐青霉素 啟動子 PCR(多聚酶鏈式反應） 沒有目的基因的空質粒 重組質粒 不能 兩 2.7

【解析】試題分析：分析質粒和含目的基因的DNA片段上存在的限制酶識別位點可知，為了保證切割的目的基因能插入切開的質粒切口，必須要求切開的質粒切口和目的基因兩端露出的堿基序列相同，才能配對連接，所以必需選擇BamHⅠ和BlgⅡ兩種限制酶切割。結合圖示，BamHⅠ會將標記基因Lac Z破壞，所以如果在LacZ處成功插入目的基因后，培養基中加入X-gal后不變為藍色，而呈白色。但標記基因Amp沒有被破壞，所以不管是否插入了目的基因的質粒，在加入有氨芐青霉素的培養基中，含有該質粒的細菌都能正常生長。

（1）由圖知，質粒上含有LacZ和Amp兩個標記基因，根據質粒和目的基因的酶切位點可知，若大腸桿菌中含有成功導入了目的基因的重組質粒，則不能使無色的X-gal變為藍色，但具備氨芐青霉素抗性。故若想篩選到成功導入目的基因的重組質粒，應在培養基中加入X-gal和氨芐青霉素，只有成功導入了質粒的細菌才能不被氨芐青霉素殺死，同時表現為白色。基因表達載體的組成除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子和標記基因等。PCR技術是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，可以在短時間內大量擴增目的基因。

（2）由圖知，若目的基因成功導入質粒中，則質粒上原有的LacZ基因被破壞，含重組質粒的細菌不能使無色的X-gal變為藍色。故若培養基上的大腸桿菌菌落顯藍色，說明質粒中不含有目的基因，LacZ基因沒有被限制酶切開，仍然具備使X-gal變色的能力。沒有導入任何外源DNA的大腸桿菌不能抵抗氨芐青霉素的攻擊而死亡，不能在篩選培養基上生存。

（3）根據堿基互補配對原則，可知BamH和Bgl兩種限制酶的識別位點如下圖所示：

可知其產生的黏性末端序列相同，可用DNA連接酶連接，但連接后的序列不能再被這兩種限制酶識別。因此再用BamH和EcoR切割連接產物，重組質粒上目的基因的兩端中必定有一端無法被BamH識別，而另一端正常被BamH切開，即存在下圖的兩種情況：

根據產物片段的長度對應圖中兩種情況，可知質粒總長度為4.6kb，目的基因的長度為3.8kb—1.1kb=2.7kb。