Question

【題目】圖甲為構建重組質粒過程中的三種備選質粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環素抗性基因。圖乙為培育轉AFPs基因（抗凍基因）番茄的示意圖，外源DNA和質粒上均標出了酶切位點及相關抗性基因，請回答下列問題。

（1）圖甲中通常選用質粒C構建重組質粒，而不選用質粒A或質粒B的原因分別是____。

（2）據圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優先選用限制酶______________切割目的基因和質粒。

（3）在構建基因表達載體過程中常把兩個啟動子串聯在一起形成雙啟動子，加在目的基因上游。雙啟動子的作用可能是___________________________________。

（4）圖乙農桿菌中的質粒應含有T-DNA，其作用是___________。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，可以對AFPs基因進行改造，最終得到相應的蛋白質，該過程需用到________工程。

（5）為使改造后的AFPs基因能夠表達，人工設計質粒D并對它的多個酶切位點進行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點為計算起點，則KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為______。

Answer 1

【答案】質粒A中沒有標記基因，質粒B的復制原點中含有HindⅢ酶切位點 BamHⅠ和HindⅢ 保證目的基因的高效轉錄（高效表達） 攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA 蛋白質 750bp

【解析】

1.基因工程的工具：

（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。

（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）運載體：常用的運載體：質粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

2.基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；

3.蛋白質過程的基本途徑是：從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）。

(1)質粒A缺乏標記基因，質粒B的復制原點中含有限制酶切割位點，可能會破壞復制原點，質粒C含有多個標記基因和酶切位點，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的質粒C作為基因工程的載體，結合目的基因兩端的酶切位點，目的基因和載體可以選擇BamH'和Hind 1同時切割，或者EcoR'和Hindll同時切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優先選用限制酶BamHI (會破壞Tc) 和HindIl切割，可以根據是否對四環素有抗性來篩選。

（3）啟動子是RNA聚合酶結合的位點，是起始轉錄的位點，雙啟動子可能是保證目的基因的高效轉錄（高效表達）。

（4）農桿菌轉化法中的Ti質粒含有的T-DNA可以攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA中。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，可以對AFPs基因進行改造，最終得到相應的蛋白質，該過程是通過設計蛋白質序列推測相關的基因序列，進而對AFPs基因進行改造，然后用改造后的基因指導更強抗凍蛋白的合成來完成的，該過程屬于蛋白質工程范疇。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。說明EcoRI酶有2個酶切位點，且兩.個位點之間的最短距離是500bp，而KpnI酶的切點在2個EcoRI酶切點之間，且距離每個EcoRI酶切點250bp，HindⅢ酶切點距離最近的EcoRI酶切點的最短距離是500bp，距離另一個EcoRI酶切點的距離是500+500=1000bp。故KpnI酶切割位點與HindIII酶切割位點最短長度250+500=750 bp。