Question

【題目】圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度（bp即堿基對）和部分堿基序列，圖2表示一種質粒的結構和部分堿基序列。現有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4種限制性核酸內切酶切割的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請回答下列問題：

（1）圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個堿基之間依次由_________________________連接。

（2）若用限制酶Sma Ⅰ完全切割圖1中DNA片段，其產物長度為_______________________

（3）若圖1中虛線方框內的堿基對被T－A堿基對替換，那么基因D就突變為基因d。從隱性純合子分離出圖1及其對應的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，產物中共有_____種不同DNA片段。為了提高實驗成功率，需要通過_____________技術擴增目的基因，以獲得目的基因的大量拷貝。

（4）若將圖2中質粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行，形成重組質粒，那么應選用的限制酶是_____________。在導入重組質粒后，為了篩選出含質粒的大腸桿菌，一般需要用添加____________的培養基進行培養，用影印法接種到只含________________的培養基中培養，可進一步篩選出含重組質粒的受體細胞。

（5）假設用BamH Ⅰ切割DNA獲取目的基因，用Mbo Ⅰ切割質粒，然后形成重組質粒，若將插入在抗生素B抗性基因處的目的基因重新切割下來，能否用BamH Ⅰ？為什么？___

Answer 1

【答案】脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖 537bp、790bp、661bp 2 PCR BamH I 抗生素B 抗生素A 不一定 因為目的基因和抗生素B抗性基因拼接處不一定出現GGATCC

【解析】

基因工程是狹義的遺傳工程，基因工程的基本原理是讓人們感興趣的基因（即目的基因）在宿主細胞中穩定高效地表達。為了實現基因工程的目標，通常要有多種工具酶、目的基因、載體和宿主細胞等基本要素，并按照一定的程序進行操作，它包括目的基因的獲得、重組DNA的形成，重組DNA導入受體細胞也稱（宿主）細胞、篩選含有目的基因的受體細胞和目的基因的表達等幾個方面。基因表達載體的構建（即目的基因與運載體結合）是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其構建目的是使目的基因能在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。影印接種法的具體過程是：將待測的濃縮菌懸液涂在合適的平板上，等其長好后作為母平板（每平板上的菌落控制在50～300個）；用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板略小的圓柱形木塊上，構成印章（即接種工具）；然后把長有菌落的母平板倒置在絲絨的印章上，輕輕印一下；再把此印章在另一含有選擇培養基的平板上輕輕印一下，經培養后，選擇培養基平板上長出的菌落與母平板上的菌落位置對應，比較影印平板與母平板上菌落生長情況，即可從相應位置的母平板上選出待測的突變型菌落。

（1）DNA的基本單位是脫氧核苷酸，DNA的兩條鏈反向平行，均由脫氧核苷酸脫水而成，脫氧核苷酸由一分子含氮堿基、一分子磷酸和一分子脫氧核糖組成。因此，圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個堿基之間依次由脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖組成。

（2）限制酶SmaⅠ的酶切位點是CCC↓GGG，其切割產生的是平末端，圖1中DNA片段含有兩個SmaⅠ酶切位點，被SmaⅠ酶完全切割后出現三個長度的片段，分別是537bp、790bp、661bp。

（3）發生基因突變后的d基因片段只有一個SmaⅠ酶切位點，完全切割后出現兩個片段長度分別是1327bp、661bp，所以從隱性純合子分離出圖1及其對應的DNA片段，被限制酶SmaⅠ完全切割后形成會2種不同的DNA片段。為了提高試驗成功率，需要通過PCR技術擴增目的基因，以獲得目的基因的大量拷貝。

（4）基因表達載體構建的過程中需要利用限制酶和DNA連接酶，限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位點位于目的基因D上，若用這兩種酶切割會被破壞目的基因D；運載體的兩個標記基因上都有限制酶MboⅠ的切割位點，用該酶切割會破壞這兩個標記基因，因此只能選用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和運載體。用限制酶BamHⅠ切割質粒后，破壞了抗生素A抗性基因，但沒有破環抗生素B抗性基因，因此首先用含有抗生素B的培養基培養大腸桿菌，能生存下來的是含有普通質粒和重組質粒的大腸桿菌。用影印法接種到只含抗生素A 的培養基中培養，則含重組質粒的大腸桿菌不能生長，對比原來只含抗生素A 的培養基上的菌落，可在原來只含抗生素A的培養基上找到相應的含重組質粒的受體細胞。

（5）假設用BamH Ⅰ切割DNA獲取目的基因，用Mbo Ⅰ切割質粒，然后形成重組質粒，拼接處可能形成了新的序列，而這個序列BamH Ⅰ不能識別，所以不一定能用BamH Ⅰ再去切割重組質粒。