Question

【題目】穿梭載體是一類具有兩種不同復制原點、能在兩種不同的生物體（物種不同）中復制的載體，一般在原核生物和真核細胞中都能復制和表達，如Ti質粒和哺乳動物表達質粒pMT2。回答下列問題。

（1）構建基因表達載體前，需先獲取目的基因。PCR技術可用于目的基因的擴增，其原理是 ________。用PCR技術從基因文庫中獲取并擴增目的基因，需要加入人工合成的___做為引物；PCR反應體系中需加入的原料是____。

（2）若要構建一個穿梭質粒，使其能夠在大腸桿菌中大量復制，且能在哺乳動物細胞中表達，質粒上除啟動子、終止子、多個限制酶酶切位點和標記基因外，還需要有____的復制原點。

（3）下圖為某種哺乳動物穿梭質粒示意圖，現欲使用該質粒表達人生長激素，但人生長激素基因所在的DNA片段上不含圖中限制酶識別序列。為使PCR擴增的人生長激素基因定向插入該質粒，擴增的人生長激素基因兩端設計的序列應含有____（填下圖中的限制酶名稱）的切割位點。

（4）將該穿梭質粒、目的基因混合后形成的重組質粒與感受態的大腸桿菌細胞混合，完成轉化過程，再從培養的大腸桿菌細胞中提取質粒，可獲得大量該質粒。在含卡那霉素的培養基中能夠生長的大腸桿菌細胞中____（填“一定”或“不一定”）含有目的基因，原因是____。

Answer 1

【答案】DNA雙鏈復制 一小段單鏈DNA 4 種脫氧核苷酸 大腸桿菌和哺乳動物 NdeⅠ和BamHⅠ 不一定 若大腸桿菌細胞中導入的是未攜帶目的基因的（穿梭）質粒，大腸桿菌細胞也能在含卡那霉素的培養基中生長

【解析】

1、PCR技術：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。

（1）原理：DNA復制；

（2）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一對引物；

（3）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）；

（4）過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。

2、基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）PCR技術是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。其原理是DNA雙鏈復制。在PCR反應體系中，需加入一小段已知核苷酸序列的DNA單鏈，以便合成引物；需加入四種脫氧核苷酸作為合成DNA的原料。擴增過程是在較高溫度下進行的，因此需要加入耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。

（2）基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、復制原點和標記基因等。穿梭載體具有兩種不同復制原點，構建一個能夠在大腸桿菌中大量復制，且能在哺乳動物細胞中表達的穿梭質粒，需要加入大腸桿菌和哺乳動物的復制原點。

（3）如果在哺乳動物的穿梭質粒中插入人生長激素基因，基因表達載體中目的基因的上游為啟動子，下游為終止子。圖示啟動子和終止子之間的限制酶有NdeI、XbaI、BamHI三種，其中XbaI有兩個酶切位點，一個位點在終止子下游，所以為使PCR擴增的人生長激素基因定向插入該質粒，擴增的人生長激素基因兩端設計的序列應含有NdeⅠ和BamHⅠ的切割位點。

（4）穿梭質粒、目的基因混合后，導入到大腸桿菌細胞的有可能是沒有攜帶目的基因的穿梭質粒，其上含有卡那霉素抗性基因，在含有卡拉霉素的培養基中能夠生長，所以在含卡那霉素的培養基中能夠生長的大腸桿菌細胞中不一定含有目的基因。